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    【技術(shù)貼】DNA 純化實驗的幾種常用方法

    發(fā)布時間: 2021-08-24  點擊次數(shù): 8589次

    DNA 純化是分子生物學(xué)研究中經(jīng)常需要用到的一種方法。一般來說,做DNA 純化有3 個目的:1. 獲得高純度的DNA;2. 濃縮DNA;3. 用DNA做測序,芯片等生物信息學(xué)方面的實驗。下面,談一談DNA純化的幾種常用方法。


    DNA 純化實驗基本上可以分為 PCR 清潔試劑盒純化法DNA凝膠回收純化法兩大類。PCR 清潔試劑盒純化法又稱為硅膠膜吸附法。因為它的原理是:硅膠膜可在高鹽條件下結(jié)合 DNA, 又可在低鹽條件下與DNA分離。而 DNA 溶液中的其他渣渣包括引物、單核苷酸、酶、礦物油、鹽離子等,因為沒有 DNA 的這種神特性,所以會被分離開來。  


    如果你的 PCR 產(chǎn)物得到的是單一條帶,*可以直接純化。那么問題來了。如果發(fā)現(xiàn)有雜帶?怎么辦?有哪些辦法可以提取得更干凈?



    那么就誕生了我們的第二種方法:DNA 凝膠回收純化法。這種方法簡單粗暴有效率,也能純化得比較*?,F(xiàn)在已經(jīng)慢慢地取代了第一種方法,成為了DNA 純化的主流方法。 擴(kuò)增時出現(xiàn)非特異性條帶,那么在膠回收時切膠很重要,切膠時盡量選擇目的基因條帶,可以將目的基因所在的膠的邊緣棄去一些,盡量不要切上含有非特異性帶的膠。切膠之后就是回收了,這里分享個小竅門,回收可以用酚氯仿。


    PCR 產(chǎn)物經(jīng)過酶切、回收等步驟后,損失太大。合適的做法是:簡化步驟、減少核酸在處理過程中的損失,讓較多量的 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒片斷進(jìn)入酶連反應(yīng)——以量取勝。DNA 凝膠回收純化法是很粗放型的,但是成功率很高。如果愿意,你可以試試。


    大致的做法是:制作 100 μL PCR 產(chǎn)物;酒精沉淀回收 PCR 產(chǎn)物;PCR 產(chǎn)物及載體酶切;跑回收膠;將回收膠上的 PCR 產(chǎn)物和載體片斷切下,回收到一個試管中;冰凍、碎膠,酚、氯仿 抽提,酒精沉淀;加入8微升水、1 微升連接酶和 1 微升連接 buffer,4 度過夜;轉(zhuǎn)化涂板。


    PCR 產(chǎn)物回收 

    1. 制備 100μL PCR 產(chǎn)物。 

    2. 將 100μL PCR 產(chǎn)物加入一 1.5mL 離心管中,再加入 400μL 雙蒸水,顛倒混勻。加入 900μL  預(yù)冷無水乙醇、20μL3M 的醋酸鈉。顛倒數(shù)次混勻。(提示 本方法使用的醋酸鈉量較小,但足夠沉淀核酸,并且無需洗鹽。) 

    3. 4℃靜置 30 分鐘,以利于核酸沉淀。 

    4. 12000rpm 4℃ 離心 15 分鐘,沉淀核酸。 

    5. 棄上清,將離心管倒置于干凈吸水紙巾上 5 分鐘。室溫下吹風(fēng)干燥。(提示 可將試管置于超凈臺吹風(fēng)干燥。如果管底有較多液體聚集,可蓋好管蓋后,輕彈管底數(shù)次,將液體分散掛在管壁上,再打開管蓋吹風(fēng)。) 

    酶切直接在回收 PCR 產(chǎn)物的試管中配置酶切體系。1%瓊脂糖回收膠回收(碎膠、酚氯仿抽提法)。 

    綜上所述,純化的主要目的就是要去除蛋白質(zhì)。而酚氯仿混合液能有效地使蛋白質(zhì)變性,同時抑制 RNAase 的活性,酚氯仿還可以減少酚在核酸溶液中的痕量。所以是一種好東西。


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