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    如何從培養(yǎng)細(xì)胞中制備細(xì)胞核基質(zhì)/中間纖維骨架結(jié)構(gòu)？

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-18　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1000次

    材料與儀器

    細(xì)胞
    Tritron X-100 抽提緩沖液
    電子顯微鏡

    步驟

    1. 在 4℃ 用 PBS 洗細(xì)胞一次。

    2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的細(xì)胞骨架緩沖液抽提細(xì)胞 3 到 5 分鐘。直到消化步驟，每 107 個(gè)細(xì)胞最少要用 1 ml 緩沖液，以后減半。

    3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提細(xì)胞 3~5 分鐘。這一步去除組蛋白 H1 和除中間纖維蛋白之外的細(xì)胞骨架蛋白。另外，這一步也可在 DNA 酶消化步驟（第 4 步）之后作，這樣也不會(huì)引起超微結(jié)構(gòu)的變化。

    抽提緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    250 mmol/L 硫酸銨

    300 mmol/L 蔗糖

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EDTA

    4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液中用無(wú) RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質(zhì) DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml，32℃ 反應(yīng) 30~50 分鐘。

    含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    50 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    5. 用抽提緩沖液清洗樣品兩次，每次 5 分鐘。

    6. （可選）樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質(zhì)核心的 10 nm 纖絲分支顯形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每種酶 400 單位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。

    2 mol/L NaCl 緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    2 mol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    7. 固定核基質(zhì)以進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)或電子顯微鏡檢測(cè)。


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