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    大鼠乳鼠成骨細胞培養(yǎng)實驗——酶消化法

    發(fā)布時間: 2021-12-05  點擊次數(shù): 1348次

    材料與儀器

    SD大鼠
    F12 *培養(yǎng)液 胰蛋白酶 Ⅱ型膠原酶 酒精
    手術(shù)器械 磁力攪拌器

    步驟

    一、實驗步驟


    1.  拉頸處死24 小時內(nèi)新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出頭蓋骨,分離頂骨和額骨,冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血,放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌, 將顱骨剪成2~5 mm2 碎片,將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min,以清除纖維組織細胞,棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。

    2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml,在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘,收集消化液,室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細胞,接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中,補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml;對靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,在5% CO2,95%空氣,37℃溫度下培養(yǎng),24 小時后可見細胞貼壁生長,胞質(zhì)開始伸展,換新鮮培養(yǎng)液,以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注:消化視具體情況而定,也可多消化 1 遍)。

    3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿。傳代時,取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶,棄去培養(yǎng) 液,傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室溫下消化3~5 分鐘,將胰蛋白酶液棄去,加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細胞收集、合并,計數(shù);用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗。代數(shù)太多,細胞老化或者分化明顯。
     
    二、結(jié)果

    如圖所示,成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似,但是不同的是,比成纖維細胞更不容易消化,尤 其是傳代次數(shù)多,細胞老化的時候,非常難消化,并且不易消化成單個細胞。
     
    圖1:成骨細胞

    圖2:成骨細胞100倍
     

    圖3:成骨細胞形成的礦化結(jié)節(jié)
    三、鑒定的方法

    1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

    2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

    3.  礦化結(jié)節(jié)檢測


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