細(xì)胞培養(yǎng)，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細(xì)胞培養(yǎng)中常常會(huì)遇到很多的細(xì)節(jié)問(wèn)題，而每個(gè)問(wèn)題都有可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。所以做好細(xì)胞的污染防治是能否順利開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的必要措施。

1.細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見(jiàn)的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長(zhǎng)桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

左邊的就是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會(huì)延軸向快速游動(dòng)，量少時(shí)培養(yǎng)基澄清。右圖是顆粒狀污染，一般培養(yǎng)基會(huì)渾濁或有白色沙狀沉淀。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁；厭氧菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)觀察到渾濁現(xiàn)象。

污染處理：由于國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒(méi)有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細(xì)菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周，效果相對(duì)還不錯(cuò)。

2. 真菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素B/T25瓶，處理一周。

注：兩性霉素毒性較大，需要在細(xì)胞有50%以上且狀態(tài)沒(méi)受大影響前處理。

3.支原體污染

支原體的危害：支原體污染可以改變細(xì)胞的特性。例如部分支原體會(huì)快速消耗培養(yǎng)液中的精氨酸，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，從而使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢或停止；同時(shí)支原體還可以改變細(xì)胞的酶譜、細(xì)胞膜成分，造成細(xì)胞染色體異常或細(xì)胞病理性改變等。上述情況會(huì)嚴(yán)重影響到使用這些細(xì)胞所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論不可靠。

（PCR法檢測(cè)細(xì)胞上清中的支原體污染）

支原體的預(yù)防與清除：由于支原體無(wú)法在鏡下直接看到，需要通過(guò)PCR法等進(jìn)行檢測(cè)才發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)污染后比較難發(fā)現(xiàn)。建議在養(yǎng)細(xì)胞每月檢測(cè)一次并結(jié)合每周抽檢，做到有污染早發(fā)現(xiàn)。對(duì)于正在進(jìn)行支原體去除處理的細(xì)胞建議每周必檢，直至出現(xiàn)陰性結(jié)果并至少維持一月。不同的細(xì)胞分開(kāi)處理，優(yōu)先處理“支原體陰性"細(xì)胞，后處理正在做去除處理的和受感染的細(xì)胞。同時(shí)，新引進(jìn)的細(xì)胞系都進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保不給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)新的污染。

4.實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞污染防治

建立良好的規(guī)章制度對(duì)減少細(xì)胞污染會(huì)有很大的幫助。包括準(zhǔn)入制度、操作規(guī)范和日常管理制度。

準(zhǔn)入制度：包括了人員的和物料的。人員需要進(jìn)行培訓(xùn)之后才能自己進(jìn)行操作，而且要符合穿戴要求才能進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，如白大褂、隔離服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品應(yīng)嚴(yán)格消毒滅菌，而購(gòu)買的物品需要從正規(guī)的、可靠的渠道購(gòu)買。新買的細(xì)胞應(yīng)檢測(cè)驗(yàn)證后再使用。

操作規(guī)范：對(duì)于常規(guī)操作最好制定規(guī)范，且實(shí)驗(yàn)室人員都要按操作規(guī)范進(jìn)行，不能隨意更改，同時(shí)也是培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)人員的良好操作習(xí)慣。比如，槍頭滴管吸完就不再二次伸入培養(yǎng)基中吸取，一次吸夠足夠量的培養(yǎng)基。加液時(shí)也應(yīng)盡量做到懸空加液，這些都可有效預(yù)防支原體污染和細(xì)胞交叉污染。另外可以的話，一次只操作一株細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞間最好有一點(diǎn)時(shí)間間隔，避免交叉污染。

日常管理制度：則包括環(huán)境及耗材試劑等的使用、清潔、保養(yǎng)等各方面的規(guī)則、方法。還有試劑耗材等的用量、庫(kù)存及采購(gòu)等的管理，包括細(xì)胞樣品的兩級(jí)庫(kù)存管理。對(duì)于不易發(fā)現(xiàn)的污染源，最好定期進(jìn)行檢測(cè)，主要是支原體污染和細(xì)胞交叉污染。

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