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    分子克隆實驗---第三章:測序結(jié)果解讀

    發(fā)布時間: 2025-03-31  點擊次數(shù): 938次

    一代測序是克隆實驗中常見的下游實驗。現(xiàn)代 DNA 測序技術(shù)源于 Sanger 鏈末端終止測序法,其工作原理與 Sanger 測序不同的是 4 組反應的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標記,每個試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光,延伸反應和鏈終止完成后,將全部 4 組反應物混合,在同一泳道進行凝膠電泳,通過激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。


    一般情況下,測序信號文件多為 *.ab1 文件,該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質(zhì)量;*.seq 文件則為 ab1 文件導出得到的測序結(jié)果序列,ab1 文件中已具有堿基序列信息,因此 *.seq 文件可不作重點關(guān)注。


    一代測序的每次測序反應能夠產(chǎn)生約 600-900bp 堿基信息,測序開始的 5 端約 50bp 左右的測序信號不穩(wěn)定,檢測 800bp 左右之后信號開始衰減,各種波之間有重疊等情況。這部分結(jié)果信息不準確,不建議參考使用。

    理想狀態(tài)的測序信號應當是獨立單一的峰形信號,波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,波峰底部沒有雜峰干擾,此時得到的堿基信息可信度超高;測序信號出現(xiàn)雙峰、套峰等情況時,該處堿基信息可信度低,需要其他測序結(jié)果共同比對分析



           

    測序問題的主要原因:
    ◆ 套峰
    a) 全雙峰:多引物結(jié)合位點(菌液、質(zhì)粒);非特異擴增(PCR 產(chǎn)物);
    b) 前雙峰:多引物結(jié)合位點,其中一套模板測序中斷(菌液、質(zhì)粒);多引物結(jié)合位點(PCR
    擴增未純化產(chǎn)物);引物二聚體或小片段干擾(PCR 產(chǎn)物純化非切膠樣品);
    c) 中間雙峰:非單克隆(菌液、質(zhì)粒);堿基缺失或等位基因雙模板(PCR 擴增未純化產(chǎn)物);
    d) 后雙峰:非單克隆(菌液、質(zhì)粒);堿基缺失(PCR 產(chǎn)物)。


    ◆ 測序信號

    a) 無信號:引物結(jié)合位點不存在或被破壞;
    b) 信號差:引物或模板的質(zhì)量不高,或引物和模板匹配性低,或樣本濃度偏低;
    c) 信號衰減:可能因測序序列的特殊結(jié)構(gòu)導致,如 Poly 結(jié)構(gòu)、重復序列、回文結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、GC 富集、AT 富集等;若為正常峰形后逐漸衰減,可能模板反應量不足;
    d) 信號中斷:模板存在高級結(jié)構(gòu),導致 dNTP 和 ddNTP 在某位點無法與模板結(jié)合;
    e) 測序移碼:測序開端移碼可能是引物降解,局部移碼可能樣本存在高級結(jié)構(gòu);

    f) 測序底峰干擾:可能測序引物不純;可能測序樣品不純混有正、反向引物。


    優(yōu)化方案:套峰

    二聚體、小片段干擾:凝膠電泳,切膠純化回收;                                                          
    多引物結(jié)合位點:更換引物測序或反向測通;
    堿基缺失:構(gòu)建單克隆后測序;
    非單克?。涸谳d體構(gòu)建克隆正確下重新挑取單克隆測序;
    非特異性擴增:優(yōu)化反應條件重新制備;

    等位基因雙模板:構(gòu)建單克隆后測序。


    測序信號

    無信號:更換引物或重新提供樣品測序;
    信號差:提供高質(zhì)量樣品測序;
    信號衰減:特殊結(jié)構(gòu)導致衰減,建議反向測序拼接;若正常峰形后逐漸衰減:提供高質(zhì)量樣品;
    測序中斷:建議反向測序測通;
    測序底峰干擾:重新制備模板,引物 PAGE 膠純化。


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